Metodický doplněk k publikaci

Obsah knihy

Metodický doplněk
ANALYTICKÝ VÝZNAM NUKLEOVÝCH KYSELIN A VYBRANÉ SEPARAČNÍ  METODY  PRO  STANOVENÍ  BIOMOLEKUL
V. Chromý         

NUKLEOVÉ KYSELINY
            Nukleové kyseliny (NA) - deoxyribonukleová kyselina (DNA) a ribonukleová kyse-lina (RNA) jsou molekulami, jejichž struktura a uspořádání v chromosomech určují genetické vlastnosti a ovlivňují organizaci a reprodukci živé hmoty. DNA má převážně dvojvláknovou strukturu a skládá se z různých sekvencí svých základních složek. Stručný přehled chemického složení NA viz /X1/.
            Určitá sekvence DNA, její část, která popisuje určitou vlastnost, je gen a soubor všech genů je genom. Řada sekvencí NA, od virů a bakterií, přes rostliny a živočichy až po člověka, je totožná. Každý druh, ale i každý jedinec má v řetězci své NA určité a jedinečné, tzv. cílové sekvence NA, které jej odlišují nejen od ostatních druhů, ale i od ostatních jedinců téhož druhu (s výjimkou jednovaječných dvojčat).
                Příklad. Určité sekvence v NA člověka jsou pro něj tak typické, jako jsou jeho papilární linie a otisky prstů. Celý genom člověka sestává z asi 30 až 35 tisíc genů a zatím nebyl podrobně popsán. Bezobratlé organismy mají až 18 tisíc genů, kvetoucí rostliny mají cca 24 tisíc genů, kvasinky 6000 a bakterie tuberkulosy asi 4000 genů. Genom člověka a šimpanze je z 98 % shodný a u dvou lidí je shoda 99,9 % - jinými slovy, k odlišnosti dvou jedinců stačí cca  0,1 % jejich genomu. Ona pouhá 0,1 % rozdílů v lidském genomu ale představuje úctyhodné číslo tři miliardy párů bází a souvisí zřejmě nejen s odlišností jedinců, ale i s genetickými anomáliemi a s jejich dispozicí k určitým chorobám.
            Genetické anomálie jsou situovány v místech zvaných SNP (Single Nucleotide Polymorphism) a lze je snadněji nalézt, protože SNP je tvořeno jedinou samotnou bází odlišnou od těch, které se jinak v dané genové sekvenci v celé populaci typicky vyskytují. Výskyt některých SNP asi nemá praktický význam, nebo o něm zatím nevíme, u jiných byla prokázána vysoká korelace s určitou chorobou. Zatím je jich známo několik desítek a jsou typické např. pro astma, určité typy rakoviny, diabetes, schizofrenii aj. Většina chorob ale koreluje s větším počtem SNP v určitém genu - tzv. Single Gene Disease, který obsahuje stovky SNP, např. cystická fibrosa, syndrom fragilního chromosomu X aj.
            Nalezení charakteristických sekvencí NA v biologickém vzorku umožňuje identifikovat nejen genetické anomálie, ale i původního nositele. V prenatální diagnostice lze určovat genetické poruchy plodu. Genetické poruchy vedoucí k malignímu množení buněk a tkání se využívají v onkologii, řešení paternitních a maternitních sporů a identifikace jedinců na základě NA je využíváno ve forenzní diagnostice v soudním lékařství apod. Takto lze u živočichů stanovovat i viry, bakterie, kvasinky apod. a diagnostikovat infekční choroby. 

PRINCIP POLYMERASOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCE
            Hlavním problémem bylo, jak ony jedinečné sekvence NA z izolovaného vzorku  získat a namnožit tak, aby bylo možné provést jejich identifikaci. Dostatek materiálu k analýze se zdařilo získat umělou replikací DNA in vitro Kary Mullisovi /X2/ na počátku osmdesátých let objevením tzv. polymerasové řetězové rakce (PCR, Polymerase Chain Reaction). Bylo sice popsáno několik jiných amplifikačních metod pro NA /X3/, největší a zásadní význam pro využití v diagnostice má zatím PCR.
            PCR je metoda pro enzymovou syntézu sekvencí DNA in vitro. Využívá dva syntetické oligonukleotidové primery (značky), které jsou komplementární s hledanou cílovou sekvencí na obou vláknech DNA. Nejprve je třeba nejprve rozdělit dvojvlákno DNA denaturací teplem (95 ^OC) na dvě vlákna na než nasednou při snížení teploty primery. Prodloužení, dosyntetizování DNA od navázaného primeru, katalyzuje termálně stabilní DNA-polymerasa. Stavebním materiálem je směs aktivovaných bází, které jsou spolu se vzorkem, polymerasou a dalšími látkami součástí reakční směsi. Celý proces PCR se provádí v termocykleru a několikrát se opakuje.
                Příklad. PCR umožňuje detekovat jediný leukocyt infikovaný HIV mezi 10⁵ neinfikovaných bílých krvinek. K tomu je třeba onen jediný leukocyt, obsahující sekvenci typickou pro HIV, pomocí PCR rozmnožit. Při 30 PCR cyklech se původní počet cílových sekvencí znásobí 10⁶ až 10⁹.
                Poznámka. Vzorky pro PCR jsou biologické kapaliny (celá krev, plasma, sérum, moč, sputum, sperma apod.), tkáně, vlasy a vousy, stěry biologických stop, suché skvrny biologického materiálu aj. Podle povahy vzorku se volí i postup jeho úpravy. V podstatě se jedná o převedení vzorku do suspenze či roztoku, popř. jeho homogenizaci, lýzu buňek a izolaci NA buď extrakcí, nebo sorpcí na vhodném sorbentu. Pro PCR je přibližně třeba 10 - 500 mg lidské DNA, 1 - 10 mg  bakteriální DNA a 0,1 - 1 mg plasmidové DNA. Konkrétní koncentrace se řídí celkovým objemem reakční směsi v PCR. Např. z 1 ml celé krve se získá cca 20 mg DNA.
            Technika PCR se často vysvětluje tak, že umožňuje nalézt jedinou jehlu v kupce sena a z ní pak vytvořit kupu jehel. Jehlou je v tomto případě specifická, cílová  sekvence DNA či RNA v biologickém vzorku. Schema PCR ukazuje obr. X-1.

IDENTIFIKACE PRODUKTŮ PCR
            Pro identifikaci produktů PCR jsou univerzálně použitelné metody gelové elektroforézy na agarose nebo polyakrylamidu. Agarosa je gel nedenaturující bílkoviny, zatím co polyakrylamid je denaturuje. Zvolená metoda závisí na velikosti produktu PCR. V řadě případů lze produkt oddělit gelovou elektroforézou a vizualizovat jej pouhým vybarvením zón stříbrem (červeně) nebo ethidiumbromidem (zóny v UV-světle fluoreskují).
            Často je nutné identitu produktu konfirmovat jeho hybridizací. Elektroforeogram se kopíruje např. blotovací technikou (otisk na nitrocelulózovou nebo na nylonovou membránu). Membrána s otiskem je inkubována v roztoku hybridizační sondy. Sonda je značena a na značce závisí další postup. Blotovací technika je sice vysoce citlivá a specifická, ale velmi pracná. Jednodušší je tzv. oligomerní hybridizace. Produkt je hybridizován přímo v roztoku sondou značenou radionuklidem, teprve pak je rozdělen na polyakrylamidu a identifikován autoradiograficky.
            Gelové elektroforéze, která je poměrně málo citlivá a vyžaduje proto větší koncentraci stanovované látky, se lze vyhnout, je-li PCR prováděna s primery značenými na svých 5´-ter-minálech biotinem (B), který tvoří s bílkovinou avidinem (A) pevnou vazbu, které se často říká můstek avidin-biotin a umožňuje snadno separovat takto značené biomolekuly. (Vzorce nukleotidmonofosfátů a číslování uhlíků v jejich sacharidové části ukazuje obr. X5). Po chemické denaturaci produktu PCR, většinou roztokem NaOH, jsou biotinylovaná vlákna nukleové kyseliny (B-NA) chycena na kuličky nebo stěny pokryté avidinem (�-A). Je přidána hybridizační sonda (S) a po jejím navázání inkubací jsou přebytečné sondy vymyty. Na pevnou fázi je zakotven komplex �-A-{B-NA-S}. Přidá se konjugát protilátky proti komplexu {A-B-NA-S} značený peroxidasou (Ab*). Zkumavka se opět promyje. Na pevné fázi je zakotven sendvič �-A-{B-NA-S-Ab*}. Přidá se peroxid vodíku (substrát pro POD), oxidoredukční indikátor a zbarvení jeho oxidované formy se měří fotometricky readerem pro mikrotitrační destičky ELISA. Pokud se použijí jiné způsoby značení, detekuje se příslušnými metodami radionuklid, fluorofor, luminofor, chromofor apod.
            PCR umožnila multiplikaci stopových množství hledaných sekvencí NA a jejich následnou separaci a identifikaci a zůstává základní a univerzílní metodou pro analýzu cílových sekvencí NA. Její podrobný popis s instrumentací uvádí /X1/. 

VYBRANÉ SEPARAČNÍ METODY PRO STANOVENÍ BIOMOLEKUL
            Řadu biomolekul a analytů lze stanovit v biologickém vzorku přímo (a bez předchozí multiplikace) některými vysoce citlivými separačními instrumentálními metodami i kvantitatvině a během několika minut. Jedná se zejména o tyto techniky:
·      Vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (High-Performace Liquid Chromatography, HPLC).
·      Kapilární zónovou elektroforézu (Capillary Zone Electrophoresis, CZE).
·      Hmotnostní spektrometrii v modifikaci MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation - Time of Flight Mass Spectrometry).
·      Hmotnostní spektrometrii v modifikaci IRMS (Isotope Ratio Mass Spectrometry)
            Po zopakování jejich principů /X4/ ukážeme na praktických příkladech jejich využití pro stanovení některých biomolekul, pro diagnózu určitých nemocí, ale i pro rychlé stanovení určitých cílových sekvencí NA i bez jejich rozmnožování PCR. 

SEPARAČNÍ METODY - OPAKOVÁNÍ
Chromatografie.
            Chromatografické dělení látek je založeno na eluci směsi dělených látek ze stacionární fáze kapalné nebo pevné pomocí fáze mobilní. Mobilní fáze může být plynná nebo kapalná. Dělené látky, které mají mezi stacionární a mobilní fází rozdílné distribuční poměry, budou mezi nimi migrovat různými rychlostmi a za určitý čas se rozdělí. Sorpce je proces, kdy se dělená látka z mobilní fáze zachytí na fázi stacionární, desorpce je proces obrácený. V chromatografii se oba procesy neustále střídají a celý systém je v dynamické rovnováze. Rozeznáváme čtyři hlavní sorpční mechanismy: adsorpci, rozdělení (obdoba extrakce), iontovou výměnu na iontoměničích a stérické vylučování (stacionární fáze má kontrolovanou porositu, dělené látky dle velikosti a tvaru póry projdou, nebo neprojdou). Adsorpce je povrchový efekt působený elektrostatickými interakcemi. Jsou to např. vodíkové můstky, vazba dipol-dipol a vazba dipol-indukovaný dipol. Dělené látky soutěží s mobilní fází o limitovaná polární vazebná místa na povrchu adsorbentu, jímž je často např. silikagel se silanolovými skupinami Si-O-Si a Si-OH, které jsou polární a slabě kyselé. Při chromatografickém dělení látky vytvářejí symetrický neboli Gaussův koncentrační profil ve směru pohybu mobilní fáze, tzv. pásy čili píky.
                Stacionárními fázemi jsou v chromatografii nejčastěji: oxid hlinitý, aktivní uhlí, silikagel, molekulová síta, křemičitan hořečnatý, celulosa, polymery typu styren/divinylbenzen, a další. V HPLC jsou to nejčastěji chemicky modifikované silikagely nebo různé kopolymery. Povrch silikagelu je díky silanolovým skupinám Si-OH polární a slabě kyselý a může být modifikován různými alkylchlorsilany s délkou alifatického uhlíkového řetězce 1 až 18, které tyto skupiny mohou nahradit a vytvořit vázané fáze. Jsou to hydrolyticky stálé siloxany s typickými vazbami Si-O-Si-C.
                Mobilními fázemi jsou v pořadí stoupající polarity: n-hexan, cyklohexan, methylbenzen, chlorované uhlovodíky, tetrahydrofuran, propanon, acetonitril, iso-propanol, ethanol, methanol, voda a další. Používají se buď jednotlivě, nebo jejich mísitelné směsi. Např. pro reversní HPLC na vázané fázi s C18 se jako mobilní fáze často užívá směs methanolu nebo acetonitrilu s vodou nebo s vodným roztokem pufru. Pro dělení bazických nebo slabě kyselých látek je velmi důležité pH, protože ionizované formy těchto látek mají pro vázanou fázi C18 menší afinitu než látky neutrální a budou eluovány rychleji.
                Kolony pro HPLC jsou buď konvenční, nebo jsou to mikrokolony. Konvenční kolony jsou trubičky z nerezové oceli o délce od 3 do 25 cm, s vnitřním průměrem 4 - 5 mm. Mikrokolony z téhož materiálu mají délku 25 - 50 cm a vnitřní průměr 1 - 2 mm.
                Detekce signálu analyzovaných látek je prováděna v mobilní fázi detektory postupně tak, jak jsou eluovány z kolony. Na fotometrickém principu jsou detektory pro UV a viditelnou oblast, dále to jsou fotodiodové array detektory, fluorimetrické detektory, detektory na základě indexu lomu a elektrochemické detektory vodivostní nebo ampérometrické (elektrochemická redukce nebo oxidace rozdělených látek). Objem detekční cely je cca 8 ml pro konvenční HPLC kolonu a asi 1 ml pro mikrokolonu. Pro stanovení málo polárních látek (např. steroidů) reverzní chromatografií se pro jejich ionizaci užívá tzv. fotosprej. Užívá toluen jako dopant a ionizaci zajišťuje kryptonová UV-lampa. Zvyšuje citlivost stanovení tím, že snižuje až 20x poměr signál/pozadí. Citlivost HPLC detektorů se pohybuje od 5.10^–7 g/cm³ pro index lomu a vodivostní detektory přes 10^–10 pro fotometrické detektory do 10^–12 pro fluorimetrické a ampérometrické detektory.
                Kvalitativní a kvantitativní analýza. Při kvalitativní analýze lze porovnávat publikovaná retenční data analytů získaná za předepsaných a definovaných podmínek (retenční čas, objem, retenční poměr). Nějčastěji se ale užívá porovnání s chromatogramem známých látek, nebo přidání známých látek k analyzovanému vzorku (porovnává se umístění píku). Při kvantitativní analýze se využívá hlavně metoda standardního přídavku. Kvantifikace se u kolonových chromatografií provádí změřením plochy píků nebo výšky píků nebo z násobku výšky píku a retenčního času.
                HPLC. HPLC je separační instrumentální technika, kde dělené látky migrují kolonou naplněnou mikročásticemi stacionární fáze rychlostmi dle jejich distribučních poměrů (afinit) pro mobilní a stacionární fázi. Mobilní fáze transportuje analyty pod tlakem 100 - 5000 psi (70 - 350 barů) s rychlostí toku asi 10 - 100 ml/min. Pořadí rozdělení závisí na chemickém charakteru dělených látek a na polaritě obou fází. Obecně platí, že polární molekuly jsou adsorbovány silněji polární stacionární fází (je-li mobilní fáze nepolární) a naopak. Mobilní fází (eluentem) může být jediné rozpouštědlo, častěji je to směs vzájemně mísitelných látek volených tak, aby byla zaručena dostatečná rychlost dělení a resoluce analytů. Při tzv. normální fázové separaci je stacionární fáze polárnější než mobilní, u tzv. reverzní fázové separace je tomu naopak.  

Elektroforéza a elektrochromatografie
            Ve své klasické formě se elektroforéza užívá k dělení směsí nabitých látek, které migrují - elektroforetická migrace - na tenké podložce s gelem (agarosa, polyakrylamid) v pufrovaném elektrolytu vlivem vloženého elektrického pole, které vytváří potenciálový gradient. Kladně nabité analyty migrují ke katodě, anionty k anodě. V klasické elektroforéze na podložce neutrální látky nemigrují a zůstávají na startu (v místě nanesení vzorku) nebo poblíž něho. Rychlost migrace každé látky je charakterizována elektroforetickou mobilitou, která je funkcí jejího náboje, molekulové hmotnosti a tvaru molekuly a zavisí také na viskositě užitého elektrolytu. Nejjednodušší a současně nejrozšířenější modifikací je kapilární zónová elektroforéza, která využívá křemennou kapiláru a nemá sorbent.
                Kapilární zónová elektroforéza (CZE). Moderní instrumentace využívají separace v křemenných kapilárách o délce 10 - 75 cm o malém vnitřním průměru 10 - 100 mm. Vložené napětí je mezi 10 - 60 kV. Tyto techniky nazýváme CE, anebo také HPCE (High Performance Capillary Electrophoresis), a to vzhledem k jejich neobyčejně vysoké účinnosti. Princip separace v CE je stejný jako v jiných modech elektroforézy, proto CE nepatří mezi techniky chromatografické. Princip CE je založen na elektromigraci, tj. na pohybu látek v elektrickém poli. K separaci dochází díky různé iontové pohyblivosti (případně různé tzv. efektivní pohyblivosti) dosažené změnou pH a komplexací iontů vhodnými ligandy. Pomocí CE lze separovat i neutrální látky po přidání povrchově aktivních látek do elektrolytu. Podstatou separace je jejich částečná „extrakce“ do vytvořených micel. Nabité micely neutrální látky unášejí a ty jsou separovány na základě jejich rozdílné rozpustnosti v micelách, nebo na základě rozdílů v distribučních koeficientech analytů mezi vodnou a micelární fází.
                Elektroosmotický tok (Electroosmotic Flow, EOF). Vnitřní povrch křemenné kapiláry naplněné vodným elektrolytem obsahuje zčásti disociované silanolové skupiny -Si-OH s pK_a asi 6,2. Na vnitřní stěně vytvořený záporný náboj je kompenzován kationty pufru a vzniká Sternova elektrická dvojvrstva. Po zapnutí elektrického pole se dají tyto kationty do pohybu, a protože jsou hydratovány, způsobují posun celého elektrolytu a tak vytvářejí mohutný EOF, který unáší ke katodě všechny přítomné látky (neutrální i ionty). Rychlost EOF vzrůstá s pH pufru a s vloženým napětím, klesá s jeho vzrůstající viskositou. Rychlosti kationtů se s EOF sčítají, u aniontů se odčítají. Nenabité molekuly se pohybují rychlostí EOF a nedělí se (obr. X-2).

Základním elektrolytem (vodivým mediem) v CE je pufr, který zaručuje současně stabilitu pH. Má zásadní vliv na konstantní mobilitu dělených látek, protože u dělených látek, které jsou slabými kyselinami, bázemi nebo amfolyty (aminokyseliny, peptidy, bílkoviny, apod.) může měnit jejich iontovou formu. Tak např. glycin bude při nízkém pH pufru v protonované formě, při neutrálním pH ve formě neutrální nebo zwitteriontové a při vysokém pH jako aniont:

H₃N⁺-CH₂-COOH   ↔   (H₂N-CH₂-COOH  ↔  H₃N⁺-CH₂-COO^–)  ↔   H₂N-CH₂-COO^–                              (X-1)

Náboj bílkovin závisí na pI a řídí se tedy pH užitého pufru (nejčastěji borátového o pH 10, který neabsorbuje v pásu kolem 214 nm, kde jsou bílkoviny detekovány). Rychlost elektroendoosmotického toku bílkovin, které migrují ke katodě, převyšuje jejich elektroforetické mobility. Prealbumin i albumin jsou kyselejší než g-glo-buliny a jsou vůči elektroosmotickému toku odolnější. Proto se bílkoviny separují pomocí CE při pH 10 tak, že albuminy procházejí detektorem jako poslední. Typické pufry. Jsou to fosfáty, boráty, MES, TRIS, apod. Užívají se většinou v koncentraci 0,05 - 0,5 mol/l, což zaručuje optimální iontovou sílu a rychlou migraci dělených látek bez produkce přebytečného Jouleova tepla. Do nich se někdy mohou přidávat různá aditiva typu povrchově aktivních, komplexotvorných, anorganických a organických látek. Anorganické soli mění konfirmaci bílkovin, organická rozpouštědla ovlivňují rozpustnost analytů i EOF, močovina solubilizuje bílkoviny a denaturuje oligonukleotidy, povrchově aktivní látky tvoří s analyty micely a kationaktivní detergenty mění v kapiláře strukturu Sternovy dvojvrstvy a tím i EOF.
                Detektory používá CE podobné jak již bylo uvedeno u HPLC. Nejobvyklejší jsou pro svou univerzálnost detektory typu UV-vis, jejichž citlivost v daném uspořádání umožňuje detekovat 10^–13 až 10^–16 molů analytů, což odpovídá citlivosti 10^–5 až 10^–8 mol/l. Citlivější je ampérometrická detekce a umožňuje stanovit až 10^–11 mol/l. Laserem indukovaná fluorescence dosahuje citlivosti 10^–14 až 10^–16 mol/l. Její nevýhodou je, že je většinou nutné analyty derivatizovat - označit je předem fluoroforem.
                CZE je nejjednodušší a současně nejrozšířenější metodou ze všech modifikací CE. Křemenná kapilára je naplněna proudícím pufrem o vhodném pH a iontové síle. Ionty se dělí podle náboje, neutrální analyty migrují stejnou rychlostí jako EOF a nedělí se. Aditiva přidávaná do pufru mohou změnit selektivitu dělení, mění hodnotu a směr EOF, efektivní mobilitu dělených látek, jejich rozpustnost, apod. 

Hmotnostní spektrometrie (MS).
            Látky (analyty) se v evakuované komoře ionizují, převedou se do plynné fáze a pak jsou rozděleny buď v prostoru nebo v čase podle poměru jejich hmotnosti a náboje (m/z). Počty iontů stejné hmotnosti vytvářejí v hmotnostním spektru pík. Kvantitativní analýza spočívá v měření počtu určitých iontů (plochy nebo výšky jejich píku) za podmínky přesného dodržení pracovního postupu.
                Ionizační techniky. Jsou voleny dle charakteru analyzovaného vzorku a analytických požadavků. Elektronový impakt (EI) využívá paprsek elektronů o vysoké energii (cca 70 eV). Kolizí elektronu s plynnou (odpařenou) molekulou analytu je vyvolána tvorba kationtových radikálů, které se dále štěpí na menší fragmenty. Chemická ionizace (CI) je proti EI šetrnější. Využívá kolizi mezi molekulami vzorku a molekulami generovanými reakčním plynem (nejčastěji methanem nebo amoniakem). MALDI (také tzv. měkká ionizace) je pro analýzu biomolekul (makromolekul) nejvhodnější a využívá přímou ionizaci z pevné do plynné fáze. Vzorek je smíchán s velkým přebytkem (cca 10⁴) matrice. Matricí jsou často slabé aromatické kyseliny. Vzorek smíchaný s matricí je vysušen, nanesen na kovovou podložku a po evakuaci je ozářen laserem o energii do cca 10 mW. Matrice absorbuje světelnou energii laseru, kterou předává vzorku a tím chrání analyt před velkou degradací. Tzv. tandemová MS se využívá hlavně pro rozlišení těch molekul, které se liší svým poměrem hmotnost/náboj. Oddělením s rozlišením různých prekurzorových iontových párů lze následně určit strukturu molekul a využít ji v klinickém screeningu. Jednotlivé ionizační techniky jsou vhodné pro molekuly s molekulovou hmotností v kDa: laser (MALDI) do 500, EI do 200. Další ionizační techniky jako je např. desorpce plazmatem je vhodná pro molekuly do cca 50 a ionizace rychlými atomy do cca 20 kDa.
                Fragmentace. Molekulární ionty vzniklé ionizací často dále disociují na menší fragmenty (ionty a neutrální molekuly o menší hmotnosti). Způsob fragmentace je pro určité molekuly a jejich funkční skupiny typický a je využíván zpětně pro identifikaci. Hypotetická molekula ABC se může po ionizaci fragmentovat a rearanžovat. Rovnice X-2 vystihuje ionizaci, rovnice X-3 až 5 vystihují fragmentaci a rovnice X-6 až 7 rearanžování molekul. Symbol ° značí kationtový radikál.

                         Detekce v prostoru a v čase. Detekce v prostoru se provádí ve fokusovacím magnetickém hmotnostním analyzátoru (jednoduchém nebo vícenásobném), kde elektromagnety (umístěné kolmo na dráhu letu částic v urychlovací trubici) nabité částice vzniklých iontů (fragmentů a rearanžovaných molekul) vzorku dle jejich m/z odkloní, takže dopadají na různá místa detektoru. Detekce v čase využívá rozdělení iontů dle jejich rychlosti, době letu úměrné poměru (m/z)^–1/2. Ionty jsou urychleny silným elektrickým polem (25 až 30 kV) a přes uzemněnou mřížku vstupují do evakuované letové trubice. Na jejím konci jsou detekovány.
                MALDI-TOF MS. Využívá šetrnou ionizaci látek dusíkovým laserem 337 nm o regulovatelném výkonu mezi 0 - 6 mW. MS, který pracuje v hlubokém vakuu, má zařízení pro ionizaci vzorku fokusovaným laserem. Roztok vzorku se smíchá na destičce s roztokem matrice. Po odpaření a vysušení rozpouštědla je destička vložena do přístroje a v hlubokém vakuu se matrice paprskem laseru ionizuje. Vzniklé ionty a nabité fragmenty matrice ionizují analyt. Částice se urychlí vloženým napětím 35 - 50 kV a detekují se letovým detektorem TOF. Analyzátor lze užít ve dvou modech. Pozitivní mod měří kationy, negativní mod anionty. Může dále pracovat v lineárním uspořádání (ionty jsou detekovány na konci přímého letu, nebo v reflektronovém uspořádání (iontové zrcadlo zlepšuje rozlišení tím, že dopadající ionty fokusuje a odráží k excentricky umístěnému detektoru). Schema analyzátoru je na obr. X-3.

MALDI byla původně cílena na analýzu peptidů a bílkovin, je ale využívána v mnohem širším měřítku pro glykoproteiny, oligosacharidy, protilátky a jejich konjugáty s léky, produkty enzymové i chemické přeměny substrátů, ale i pro oligonukleotidy, NA a produkty PCR, cyklosporiny, stanovení různých glycerolů, apod. MALDI má velmi malou spotřebu vzorku (řádově mikrolitry). Lze analyzovat vzorek s obsahem stanovaného analytu v nano- až femtomolech. Přitom neinterferují soli, pufry a denaturační činidla ani ve velkém přebytku. Při ionizaci laserem vzniká jen málo fragmentů, hmotnostní spektra lze proto snadněji interpretovat a analyzovat i složitější směsi. V typickém hmotnostním spektru převládají jedno- až dvojnásobně protonované ionty.
                Hmotnostní spektrometrie v modifikaci IRMS. Užívá se s výhodou k dělení isotopů. V laboratorní medicíně je IRMS využívána v gastroenterologii v dechových testech, které jsou většinou založeny na detekci vydechovaného oxidu uhličitého. MS se ale využívá i pro certifikaci kalibračních a kontrolních materiálů v biologické matrici tzv. definitivními metodami, obvykle v kombinaci s plynovou chromatografií nebo s HPLC. Schema IRMS pro dechové testy ukazuje obr. X-4. Značení substrátů pro IRMS v gastroenterologii se dnes provádí přirozeným, neradioaktivním, stabilním, minoritním isotopem uhlíku ¹³C. Přirozený uhlík je tvořen z 98,89 %  isotopem ¹²C a z 1,11 % isotopem ¹³C. Kyslík tvoří tři přirozené isotopy ¹⁶O (99,76 %), ¹⁷O (0,04 %) a ¹⁸O (0,20 %), které jsou v tomto poměru obsaženy i ve vydechovaném vzduchu.
                Princip stanovení poměrů isotopů v dechových testech IRMS. Po podání substrátu značeného ¹³C a jeho metabolisaci se obsah ¹³C relativně zvýší i v CO₂ ve vydechovaném vzduchu. Stanovení zvýšení poměru ¹³CO₂/¹²CO₂ nad přirozenou míru vyžaduje vysokou míru přesnosti a pro tyto účely je technika MS přímo ideální. Pro měření isotopových poměrů v oxidu uhličitém jsou postačují MS s jednofokusačním magnetickým sektorem vybaveným třemi kolektory. Vzorek dechu je nejprve zbaven vody a oxid uhličitý je oddělen od ostatních plynů (od molekul O₂ a N₂) plynovou chromatografií v kapilární koloně. Kolona je plněna molekulovým sítem, mobilní fází je helium. Oddělené molekuly oxidu uhličitého jsou ventilem puštěny do vlastního MS. V iontovém zdroji MS-analyzátoru jsou molekuly oxidu uhličitého ionizovány na ionty s jednotkovým nábojem - na kationtový radikál:

                     CO₂  +  e^-  →  CO₂°⁺  +  2e^-                                                    (X-8)

kde ° značí volný, nepárový elektron. Dle isotopového složení vznikají kationové radikály CO₂°⁺ s různým zastoupením isotopů. Ionty ¹²C¹⁶O₂°⁺ jsou snímány prvým kolektorem jako celková hmota  m/z = 44. Ionty ¹³C¹⁶O₂°⁺  jsou snímány druhým kolektorem jako hmota m/z = 45. Na druhý kolektor je naladěna dynoda detektoru. Pro korekci je analyzátor vybaven ještě třetím kolektorem pro ionty ¹²C¹⁶O¹⁸O°⁺ o m/z = 46 vzniklé z molekul oxidu uhličitého obsahujícího oba hlavní kyslíkové isotopy. Isotop ¹⁷O je přítomen jen v zanedbatelném množství 0,04 %, při tomto stanovení neruší a jeho vliv není třeba kompenzovat.

Vlastní MS-analyzátor (obr. X-4) sestává z ionizačního zdroje (nejčastěji na principu elektronového impaktu), urychlovací trubice s vloženým napětím 2 - 2,2 kV (vhodným pro urychlení CO₂°⁺), obloukového permanentního magnetu a sady tří kolektorů s detektory pro snímání iontových proudů. Celý hmotnostní analyzátor je evakuován na (5 - 7).10^–7 mBar. Do fokusačního prostoru vletí ionty CO₂°⁺ s nábojem z.e o hmotnosti m rychlostí v. Rychlost a svou kinetickou energii získají ionty průletem trubice (pole) s vloženým napětím. Obloukový permanantní magnet vytváří magnetické pole a v něm se dráhy letu jednotlivých iontů zakřivují vlivem dostředivé síly magnetického pole. Protože všechny měřené ionty mají jednotkový náboj, závisí změna zakřivení jejich letové dráhy jen na jejich rozdílné hmotnosti. Magnetické pole má současně fokusační účinek a soustřeďuje ionty o stejném náboji a hmotnosti do jednoho místa, kde je proud měřen. Polohování (nastavení) magnetu a kolektorů je prováděno při ladění analyzátoru. Každý vzorek měřeného vzduchu je porovnáván s kalibračním množstvím referenčního oxidu uhličitého o vysoké čistotě. Z hodnot proudů snímaných třemi kolektory je vypočteno číslo charakterizující naměřený poměr ¹³C/¹²C.      

PŘÍKLADY  VYUŽITÍ  INSTRUMENTÁLNÍCH  SEPARAČNÍCH  METOD 

HPLC a hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF
            Jako společný příklad pro užití jak HPLC, tak i MALDI-TOF MS, bylo vybráno stanovení některých typických nukleotidmonofosfátů, které jsou markery dědičných změn při diagnostice mentální retardace způsobené defektním genem FMR 1, který vyvoláva syndrom fragilního chromosomu X (fra X).
                Vysvětlivka. Fra-X (Fragile X syndrome) je po Downově chorobě druhou nejčastější genetickou příčinou vrozené mentální retardace /X5, X6/. Tuto genetickou chorobu způsobuje defektní gen FMR 1 (Fragile X Mental Retardation Gene 1). Patří mezi mutace způsobené zmnožením trinukleotidových repeticí a koreluje s větším počtem SNP (Single Nucleotide Plymorphism) v určitém genu - tzv. Single Gene Disease, který obsahuje stovky SNP. Fra-X je charakteristický zmnožením repetice CGG a následnou methylací cytosinu. Methylace cytosinu souvisí s expresí genů. Ty, které se v daném vývojovém stadiu vývoje mnohobuněčného organismu neprojevují, obsahují methylovaný cytosin, zatím co aktivní geny methylovány nejsou. Methylací cytosinu v sekvenci CGG dochází k potlačení exprese genu, nepřítomnosti příslušné mRNA a proteinu, který kóduje, což se navenek projeví syndromem fra-X. Podle obsahu deoxycytidinmonofosfátu (dCMP) a jeho methylovaného derivátu (mdCMP) a podle počtu repeticí (CGG)_n může mít gen FMR 1 tři stadia (tabulka X-1). FMR 1 normálně obsahuje průměrně 29 repeticí CGG. V tzv. premutačním stadiu (bez masivní methylace cytosinu) se počet repeticí zvyšuje až do 200 (zatím bez projevu choroby, ale již se přenáší na další generace). V mutačním stadiu se celá CGG methyluje, počet repeticí jde řádově do tisíců a choroba se plně projeví. 

Tabulka X-1. Stadia genu FMR1.

             Na chromatogramu HPLC i na hmotnostním spektru MALDI-TOF jsou při analýze vzorků DNA detekovány jako hlavní složky spektra nukleotidy guanosin-5´-monofosfát (GMP), thymidin-5´-mono-fosfát (TMP), adenosin-3´-monofosfát (AMP), 2´-deoxycytidin-5´-monofosfát (dCMP) a 5-methyl-2´-deoxycytidin-5´-monofosfát (mdCMP). Strukturní vzorce ukazuje obr. X-5.

Poznámka. Defektní gen FMR 1 je zatím v prenatální diagnostice stanovován pomocí PCR na základě mnohonásobného zmnožení a methylace deoxycytidinmonofosfátu v sekvenci bazí (CGG)_n. Defektní gen má podstatně zvýšené koncentrace 2´-deoxycytidin-5´-monofosfátu (dCMP) a 5-methyl-2´-deoxycytidin-5´-mono-fosfátu (mdCMP), které lze využít k jejich stanovení (diagnostice choroby) oběma instrumentálními metodami /X7/.
            HPLC. Nukleotidy, které obsahují purinové nebo pyrimidinové báze (spolu s cukernou složkou a kyselinou fosforečnou), se většinou nacházející v tautomerní keto- a aminoformě. Při změně pH se v roztoku mění na fosfátové anionty a současně se mohou měnit i jejich tautomerní formy, které mají rozdílnou polaritu a tedy i afinitu ke stacionární fázi. K jejich stanovení HPLC se využívá chromatografie na obrácených fázích, kdy je polarita stacionární fáze nižší než u fáze mobilní /X8, X9/. Retence se zvyšuje s klesající polaritou vzorku, se zvyšující se molekulovou hmotností a s rostoucí polaritou mobilní fáze. K detekci lze s výhodou využít fotometrický UV-detektor, protože všechny nukleotidy mají v absorpčním pásu 250 až 300 nm typická absorpční maxima. HPLC-spektrum uvedených nukleotidů ukazuje obr. X-6.

Provedení. Spektrum vzorku DNA na obr. X-6 bylo získáno na koloně 250 x 4 mm naplněné sorbentem Nucleosil 100-C18 o zrnění 5 mm /X9/. Do analyzátoru bylo injektováno 5 ml vzorku. Rychlost mobilní fáze byla 0,8 ml/min. Byl užit UV-detektor s diodovým polem, vlnová délka 270 nm. Mobilní fáze sestávala z fosfátového pufru 5 mmol/l o pH 5, který obsahoval současně 1 % methanolu. Kvantifikace píků obou nukleotidů byla prováděna metodou standardního přídavku.
            Ve vzorcích lidské DNA lze touto metodou kvantitativně (a podstatně rychleji než pomocí PCR) stanovit oba typické nukleotidy. Předností HPLC je vysoká dělící schopnost, možnost automatické detekce, identifikace a kvantitativního vyhodnocení chromatogramu.
            Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF. Jako příklad využití MALDI je opět uvedeno stanovení nukleotidmonofosfátů dCMP a mdCMP /X7/. Hmotnostní spektrum uvedených nukleotidmonofosfátů ukazuje obr. X-7. Takto lze detekovat nukleotidy v množství cca 1 nmolu až 10 fmolů (tj. 10^-9 až 10^-14 mol/l).

Provedení. Spektrum na obr. X-7 bylo získáno ionizací vzorku DNA v matricí /X9/. Jako fosfátové estery jsou studované nukleotidy v roztoku o pH 2 - 12 přítomny ve formě svých aniontů. Při jejich ionizaci a desorpci dochází především k tvorbě aniontů, proto byla prováděna analýza MALDI v negativním modu. K zabránění tvorby aduktů aniontů nukleotidů s ionty alkalických kovů (vedou ke snížení signálu) byl do matrice přidán dihydrogencitronan amonný. Byl připraven jeho roztok v methanolu o koncentraci 0,1 mol/l. Do něj byla přidána matrice, až vznikl její nasycený roztok. Na destičku přístroje byl nanášen 1 ml směsného roztoku obsahující stejný díl analytu a nasyceného roztoku matrice s citronanem amonným. Obsah dCMP a mdCMP ve vzorcích DNA byl stanoven metodou standardního přídavku.
            Porovnáme-li výsledky obou instrumentálních metod, lze je pro diagnostiku fra-X považovat za rovnocenné.

            Určení struktury Humaninu pomocí MALDI-TOF MS. Jiným příkladem pro využití MS je určení struktury a molekulové hmotnosti polypeptidů. Za příklad poslouží polypeptid Humanin, který byl prokázán v mozkové cDNA, kde působí jako neuroprotektivní faktor proti Alzheimerově chorobě /X10/. Bylo zjištěno, že Humanin chrání tkáňové zdravé buňky před genovými mutanty (i před tzv. Švédským mutantem) o nichž se předpokládá, že tuto chorobu způsobují.
                Vysvětlivka. Polypeptid, který nazvali Humanin, objevili, izolovali a popsali Japonci Y. Hashimoto a kol. Humanin je lineární polypeptid sestávající z 24 aminokyselin, který má v pozici 8 poněkud neobvykle zabudovaný cystein. Náhrada cysteinu alaninem vede ke ztrátě jeho neuroprotektivního účinku. Pokud se ale nahradí v původním Humaninu serin na pozici 14 glycinem, vzrůstá jeho aktivita až 1000x. Oba polypeptidy, přirozený Humanin i jeho mnohem účinnější syntetický derivát [Gly 14] Humanin, již byly syntetizovány a jsou uvažovány jako léčiva proti Alzheimerově chorobě.
            Bylo nalezeno, že Humanin obsahuje (v uvedeném pořadí): Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-(Leu)₄-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-(Arg)₂-Ala. Má molekulovou hmotnost M_r = 2686,26 a sumární vzorec je C₁₁₉H₂₀₃N₃₄O₃₂S₂. Protože hmotnostní spektrum Humaninu a postupy, které vedly ke zjištění jeho struktury a molekulové hmotnosti jdou nad rámec učebnice, odkazujeme čtenáře na podrobnosti v /X10/. 

Kapilární zónová elektroforéza
            Příkladem užití CZE v bioanalýze je stanovení některých purinů a pyrimidinů jako markerů poruch metabolismu. Purinové metabolity jsou významnou skupinou látek, které se účastní většiny biochemických reakcí. Purinové a pyrimidinové nukleotidy jsou základními složkami NA a jsou i součástí řady koenzymů. Nukleotidtrifosfáty (zejména ATP) představují pro buňku zdroj energie. Poruchy purinového metabolismu jsou např. spojeny s hyperurikemií (dnou), deficit hypoxanthinfosforibosyltransferasy vede k syndromu Lescha-Nyhana, apod. Poruchy pyrimidinového metabolismu vyvolávají např. hereditární orotacidurii a řadu dalších chorob. Jako modelový příklad použití CE /X11/ byla zvolena separace bází adeninu, thyminu, guaninu, uracilu, hypoxanthinu, xanthinu a močové kyseliny ve vodných roztocích (např. v moči).
                Provedení. Základním elektrolytem byl borátový pufr 30 mmol/l o pH 10,2. Vzorek byl dávkován  hydrodynamicky 10 s, separační napětí 15 kV, teplota 25 ^oC, UV-detekce při 260 nm.

Metodu lze užít pro diagnostiku xanthinurie a deficitu enzymu hypoxanthinfosforibosyl-transferasy. Puriny a pyrimidiny lze detekovat UV-detektorem v pásu kolem 260 nm. Elektroforeogram směsi bází a močové kyseliny ukazuje obr. X-8. Modelový pokus ukazuje, že CZE lze užít pro rychlé dělení hlavních purinů a pyrimidinů a využít ji v diagnostice pro ně typických chorob. Podrobnovsti o instrumentálních metodách viz /X1/. 

Hmotnostní spektrometrie v provedení IRMS
            Velkou skupinu poměrně nových metod tvoří testy prováděné z dechu po orálním podání vhodně značených substrátů, které jsou metabolicky enzymově štěpeny na produkty použitelné pro identifikaci stanovovaného analytu. Finálními analyty řady dechových testů jsou oxid uhličitý a voda, které jsou současně i finálními metabolity všech aerobních organismů. Analytem je tedy buď příslušný enzym, nebo i jeho insuficience a společný znakem dechových testů na oxid uhličitý je enzymy katalyzovaná přeměna substrátu (při enzymové insuficienci přeměna neprobíhá normálně a substrát je metabolisován jinak), která se projevuje v poměru značeného a neznačeného CO₂ ve vydechovaném vzduchu. Jsou odebírány vzorky vydechovaného vzduchu a v něm je nejčastěji měřen CO₂ /X12, X13/. Odebírají se většinou dva vzorky dechu před orálním podání (před vypitím roztoku nebo snězením stravy se značeným substrátem) a dva vzorky po určité době po aplikaci substrátu, která je dostatečná pro vznik CO₂.
                Poznámka. Prozatím bylo nalezeno /X14/, že dech obsahuje až 797 sloučenin, z nichž je cca 114 těkavých (např. acetaldehyd, aceton, acetonitril, benzen, methan, kyselina octová a další kyrboxylové kyseliny, isopren, amoniak a některé aminy, ethanol apod.). Dech kuřáků obsahuje navíc např. 2,5-dimethylfuran. Vyšší obsah amoniaku v dechu koreluje s chrobami jater, vyšší obsah methanu souvisí s výskytem učitých typů bakterií v gastrointestinálním traktu, vyšší obsah acetonu koreluje s diabetem, ethanol s požíváním alkoholu apod.
            Vhodný enzymový substrát značený minoritním a stabilním isotopem ¹³C poskytuje značné diagnostické možnosti. Při užití jednotné značky pro více typů substrátů lze totiž provedení řady testů a stanovení analytů a jejich metabolitů automatizovat a k analýze využít jediný univerzální IRMS analyzátor v kombinaci s GC. Již vyvinuté a experimentálně či běžně používané gastroenterologické testy a jejich substráty ukazuje tabulka X-2. 

Tabulka X-2. Dechové testy se substráty značenými isotopem ¹³C /X12/

             Nejpřesnější metodou pro stanovení poměru ¹³C a ¹²C ve vydechovaném vzduchu je isotopová hmotnostní spektrometrie - IRMS (Isotope Ratio Mass Spectrometry). K analýze stačí jen několik mikrolitrů vzduchu, který je odebírán do speciálních zkumavek na 5 - 10 ml. (Pacient vydechuje trubičkou do zkumavky, ke konci výdechu se trubička pomalu vytahuje a zkumavka se ihned uzavře zátkou). Zkumavky lze na analýzu zasílat poštou. Analýzu lze automatizovat, protože MS-analyzátor je kompatibilní s podavačem vzorků /X13/.Pro ilustraci probereme jako příklad prvý z testů uvedených v tabulce X-2.

                Poznámka. Poměr isotopů uhlíku a kyslíku v oxidu uhličitém v dechu lze detekovat i na základě rotačního a vibračního pohybu jejich IR spektry - NDIRS (Nondispersive Isotope-selective Infrared Spectroscopy). IR-detekce má ale ve srovnání s MS o více než o řád nižší citlivost a k analýze je třeba 100 až 700 ml vzduchu. Provedení odběru je podobné, vzduch je vydechován do váčků krytých Al-folií. Jejich zasílání poštou se nedoporučuje a analýzu vzorků z váčků nelze automatizovat /X15/. Obě metody detekce oxidu uhličitého jsou užívány hlavně pro gastroenterologická vyšetření. K detekci poměru obou isotopů v oxidu uhličitém lze využít i optogalvanický princip měření s paprskem laseru - zatím není v laboratorní medicíně využíván.
                Příklad testu na H. pylori. H. pylori je bakterie, která je vlastním infekčním agens zodpovědným za chronické gastritidy, které mohou vyústit až v duodenální nebo žaludeční vředy (nebo obojí). Postihuje údajně 20 - 40 % severoamerické a snad až 70 % východoasijské populace. Léčba spočívá v eradikaci H. pylori antibiotiky, někdy i v kombinaci s preparáty na bázi Bi. Analytem je vlastní bakterie, resp. její typická povrchová ureasová aktivita ve smyslu rovnice X-2.
                Test se provádí nalačno, pacient nesmí alespoň 2 hodiny jíst, pít a kouřit. Následuje vypití 0,2 l přírodního, neslazeného pomerančového džusu a za dalších 5 - 10 minut se podá nápoj obsahující 50 mg močoviny značené stabilním isotopem ¹³C. Analyzuje se dech pacienta  před (obvykle 2 vzorky) a 30 minut po podání močoviny (opět 2 vzorky). V dechu se stanovuje poměr oxidu uhličitého se značeným a neznačeným uhlíkem. Značkou je ¹³C a poměr se stanovuje hmotnostní spektrometrií, nebo na základě rozdílů v jejich rotačních a vibračních IR-spektrech. Kriteriem pro pozitivitu testu je rozdíl poměrů ¹³CO₂/¹²CO₂ ve 30. a 0. minutě a test je pozitivní, je-li rozdíl větší než 5 pomile. Test je doporučeno opakovat 4 - 6 týdnů po ukončení eradikační terapie.
            Neinvazivní stanovení analytů a provedení určitých funkčních testů instrumentálními analytickými technikami neustále rozšiřuje možnosti analytické chemie v laboratorní medicíně. 

Literatura ke kapitole X.
X1. Chromý, V., Fischer, J., Havel, J., Votava, M.: Bioanalytika - Analytická chemie v laboratorní medicíně. Masarykova univerzita v Brně, 2002.
X2.  PCR - The Plymerase Chain Reaction. Eds.: K. B. Mullis, F. Ferré, R. A. Gibbs. Bikrhauser, Boston, 1994.
X3.  Pavlík, E., Chaloupecký,V.: Molekulárně biologické techniky pro mikrobiologickou diagnostiku, část 6, Firemní publikace Roche CZ.
X4.  Kealey, D., Haines, P.J.: Analytical Chemistry (Instant Notes), BIOS Sci. Publ. Ltd., Oxford 2002, UK.
X5.  Hatina, J., Sykes, B.: Lékařská genetika. Academia, Praha 1999.
X6.  Bardoni, A., a kol.: Brain Research Bulletin, 2001, 56,375.
X7.  Havel, J., Trbušek, V., Humplíková, S.: nepublikované výsledky.
X8.  Havliš, J., Madden, J.E., Revilla, A.L., Havel, J.: Journal of Chromatography B, 755,2001,185.
X9.  Humplíková, S.: Separace a stanovení nukleotidmonofosfátů jako markerů dědičných změn. Diplomová práce, KACH-PF, Masarykova univerzita v Brně, 2002.
X10.  Hashimoto, Y. a kol.: Biochem.Biophys.Res.Comm. 283, 2001,460.
X11. Péterová, I.: Separace a stanovení purinů a pyrimidinů jako markerů poruch metabolismu metodou CE a MALDI-TOF MS. Diplomová práce, KACH-PF, Masarykova univerzita v Brně, 2002.
X12. V. Voříšek a kol.: Klin. Biochem. Metab. 7, 1999,217.
X13. Informační brožury a operační manuál k analyzátoru AP 2003 (Level 2), fa Infai GmbH, SRN.
X14. S. Praun, J. Villinger: Clinical Laboratory International 26(2),2002,23-25.
X15. Informační brožury a operační manuál k analyzátoru ISOMAX 2000, fa Isodiagnostica Inc., Edmonton, Alberta, Kanada.