Využití molekulárně genetických objevů k časné diagnostice rizika nádorového onemocnění

Využití molekulárně genetických objevů k časné diagnostice rizika nádorového onemocnění

Kolorektální karcinom, který patří k nejrozšířenějším nádorovým onemocněním v rozvinutých zemích, může být při velmi časné diagnóze úspěšně léčitelný (v lokalizovaném stadiu až  90 %). Existují genetické abnormality, které vedou nejprve k benigní proliferaci buněk sliznice tlustého střeva tj. k tvorbě polypů, dále pak adenomů a nakonec ke vzniku adenokarcinomu, popřípadě adenokarcinomu brzy metastazujícímu. Asi  1/3 populace mívá po padesátce adenomy tlustého střeva; ale jen u 10 % vznikne  karcinom. Tyto adenomy možno klasifikovat podle jejich velikosti, patologie (makroskopická struktura) a dysplazie (mikroskopická struktura) na málo a na vysoce rizikové. Histopatologická krité1ria nejsou však dostatečně objektivní. Mnohem lepší je průkaz mutace genu K-ras, který patří k protoonkogenům, uplatňujícím se v kaskádě transdukce signálu a je tedy částečně odpovědný za přeměnu adenomu na adenokarcinom. Mutace genu K-ras se většinou objevují v exonu 1, a to buď na kodónu 12 (GGT) nebo 13 (GGC). Oba triplety (GGT i GGC) kódují glycin. Vznikne-li mutace na jedné z obou bazí (kupř. GGT®GCT), pak v sekvenci polypeptidu je glycin nahrazen alaninem. Tuto mutaci lze detekovat pomocí minisekvenační techniky. (Kupř. SNaPshot ddNTP Primer Extension Kit, Applied Biosystems).  

Průkaz onkologických markerů pomocí DNA-mikroaray testů

    Tato technika spočívá v umístění tisíců imobilizovaných DNA sekvencí oligonukleotidových značek v miniaturizovaném čipu, který má rozměry mikroaudiokazety nebo i menší. Každá vybraná DNA- sekvence má svoji tečku na mikrodestičce (zatím je možné navzorkovat až 2000, ale hovoří se o možném limitu 65 000 – 75 000). Pro detekci určitého nádorového onemocnění nebo jeho zvýšeného rizika je však zapotřebí  obvykle 10 –30 teček s DNA-sekvencemi. Hledají se tak subtilní alterace DNA – polymorfismy, které vedou ke změněné expresi kódovaných proteinů ke změnám v jejich aktivitě, která u vyšetřované osoby kupř. zvyšuje náchylnost vůči působení kancerogenů nebo promotorů nádorové transformace. Velmi zjednodušeně lze princip metody popsat takto: Nejprve se izoluje vzorek DNA z buněk odebraných vyšetřované osobě a ten se označí fluorescenčním činidlem. Označená DNA se pak hybridizuje se vzorky (tečkami) určitých DNA sekvencí (DNA array) na destičce. Po promytí se pozoruje (měří) fluorecence na „DNA-array“  a hodnotí pomocí počítače. Takto byla kupř. provedena genotypová klasifikace (subtypy) akutní  lymfoblastické nebo akutní myeloidní leukemie. Podobně je testována exprese genů BRCA1 a BRCA2, které jsou markerem genetického rizika vzniku adenokarcinomu mléčné žlázy nebo ovaria.  

Otázky 

1. Které regulační molekuly jsou v průběhu každého buněčného cyklu vždy syntetizovány a opět degradovány (vyber)

A.     Růstové faktory
B.     Cyklin-dependentní kinasy (cdk)
C.     Cykliny
D.     Proto-onkogeny
E.      Tumorové supresorové geny

Odpověď: C       

2. Které z následujících tvrzení je (jsou) správné ? 

A.     Produkty protoonkogenů vysílají stimulační signály k buňkám
B.     Nádorové buňky vykazují obvykle několik genetických lézí
C.     Všechny protoonkogeny kódují kinasy
D.     Produkty antionkogenů potlačují proliferaci buněk 

            Odpověď: A, B, D 

3. Nejčastější translokace chromosomů nalézaná u chronické myeloidní leukemie
              dospělých je :

A.     t(8;14)
B.     c-myc protoonkogen
C.     c-jun a c-fos protoonkogeny
D.     bcr a abl protookogeny
E.     t(9;21) 

             Odpověď: D 

4. Které tvrzení je správné?

A: Plasmatická membrána je nepropustná pro všechny molekuly s nábojem.
B. Kanálové proteiny se musí nejprve navázat na molekuly solutů před tím, než vyčlení ty, které mohou projít.
C: Bez trvalého přísunu energie se buňky rozpadnou.
D: Přenosové proteiny dovolují solutům procházet membránou mnohem rychleji než mimo buňku.
E: Plasmatická membrána mnohých živočišných buněk má otevřené K⁺-kanály, i když koncentrace K⁺ v cytosolu je mnohem vyšší než mimo buňku.
F: Membránový potenciál axonu se dočasně stane více negativní, když jej excituje akční potenciál.

             Odpovědi:              C: ano 

Příklady pacientů 

1.      Muž, 48 roků, delší dobu se cítí unavený, ubývá na váze, občas se mu spustí krev z nosu, cítí napětí v levém horním kvadrantu břicha. V krevním obraze má mírnou anemii, thrombocytopenii a především 125 000 leukocytů/ml, s výrazným posunem do leva k blastům. Biochemické vyšetření vykazuje hyperurikemii (490 mmol/l).  

Otázky:
1.      Jaká je nejpravděpodobnější diagnóza a která vyšetření je vhodné provést ?
2.      Co to je Ph¹-chromosom a jak vzniká ?
3.      Které  onkogeny jsou pro toto onemocnění charakteristické ?
4.      Které signální molekuly hrají důležitou roli v patogeneze tohoto onemocnění ?
5.      Jak byste vysvětlili hyperurikemii u tohoto pacienta ?  

Odpovědi:

Ad 1): Jde o chronickou myeloidní leukemii. K dalším laboratorním vyšetřením patří vyšetření kostní dřeně. Kostní dřeň je hypercelulární, s poměrem myeloidní : erythroidní řada >1 : 15 (20) oproti normálu 1 : 3. Další specializované testy zahrnují vyšetření cytogenetické a vyšetření onkogenních markerů.  

Ad 2: Ph¹-chromosom (Philadelphia chromosom) je abnormální chromosom 22 (je nalézán
v 80-95 %). Vzniká reciproční translokací mezi dlouhým raménkem chromosomu 9
a chromosomu 22 ; t(9;22).

Ad 3: Molekulární změna translokace t(9:22) znamená translokaci protoonkogenu c-abl chromosomu 9 do specifické oblasti zlomu na chromosomu 22 za vzniku chimerického genu  bcr-abl. Tato změna má za následek produkci nádorově specifického fosfoproteinu p210, který má trvale zvýšenou aktivitu tyrosinkinasy, což způsobuje buněčnou proliferaci bílé řady, nezávislou na normální regulaci a kontrole růstových faktorů.

Ad 4) V patogenezi chronické myeloidní leukemie hrají důležitou úlohu STAT- proteiny, především STAT 1, 3 a 5. STAT 5 je fosforylován bcr-abl-tyrosinkinasou, STAT 1 a 3 serin- kinasou, která sice neaktivuje STAT- proteiny přímo, ale amplifikuje aktivaci po následné tyrosinové fosforylaci. Aktivované STAT-proteiny se dostávají z cytoplasmy do jádra, kde spouštějí transkripci genů pro růstové faktory.

Ad 5) Hyperurikemie je způsobena rozpadem jaderných elementů (blastů), což má za následek nadměrný katabolismus purinů a tedy i jejich konečného metabolitu - močové kyseliny. Klinickým projevem vypadávání močové kyseliny z roztoku bývá dnavá artritida nebo nefrolitiáza.  

2.      Muž 49 roků, při preventivní prohlídce měl pozitivní test na okultní krvácení ve stolici. Při kolonoskopii byl objeven polyp. Po jeho odstranění  pacient docházel na pravidelné  kontroly. Po jedné z nich (za 1 rok) byl znovu nalezen polyp. Lékař doporučil provést molekulárně biologické vyšetření na přítomnost onkogenu v extirpované tkáni.

Otázky:
1.      Jaké vyšetření onkogenu přichází v úvahu při podezření na kolorektální karcinom ?
2.      Jak se liší normální proto-onkogen od tohoto typu onkogenu ?
3.      V které fázi transdukce signálu působí produkt uvedeného onkogenu ?

Odpovědi:

Ad 1) Vyšetřuje se ras-onkogen, který vzniká bodovou mutací c-ras-proto-onkogenu.

Ad 2)  Onkogen c-ras se liší od svého normálního partnera v tom, že bodovou mutací v kodonu 12 (pozice 35 sekvence DNA) je thymin (T) nahrazen guaninem (G).   Tato záměna v sekvenci DNA způsobuje, že v kódovaném proteinu je místo glycinu valin. 

Ad 3) Proto-onkogen ras kóduje transdukční proteiny zvané G-proteiny (váží GTP), které se podílejí na přenosu signálu z růstového faktoru na intracelulární protein. Normální Ras se aktivuje vazbou s GTP, při čemž dochází k hydrolýze GTP na GDP a anorganický fosfát; tím se Ras dostává opět do inaktivního stavu. Mutovaný Ras však zůstává stále aktivní, což vede k pokračující stimulaci růstu (proliferaci) buněk.