4.11. Mitochondrie
Jsou to organely (1-2 mm délky a 0,1-0,5 mm šířky ) obdařené dvojí membránou, vnější a vnitřní, každá s jinými vlastnostmi, složením i původem. Vnitřní membrána je mnohonásobně zprohýbána a její invaginace do nitra mitochondrie tvoří tzv. kristy. Mitochodrie mají dva kompartamenty: mezimembránový a tzv. mitochondriální matrix. Vnější membrána se vyvinula v průběhu fylogeneze z plasmatické membrány při endocytóze aerobních bakterií, které zůstaly v buňce jako organela. Vnější membrána je proto dobře propustná pro většinu malých molekul (děje se tak tzv. poriny), vnitřní membrána má selektivní permeabilitu jen pro několik druhů molekul, a to těch, které tvoří substráty nebo produkty respiračního řetězce a oxidační fosforylace (pyruvát, sukcinát, 2-oxoglutarát, malát, citrát; dále ATP, ADP anorg. fosfát; CTP, GTP, CDP a GDP). Do vnitřní membrány je zabudován komplex enzymů řetězce elektronového transportu a fosforylace ADP na ATP. V mitochondrální matrix jsou enzymy citrátového cyklu s výjimkou sukcinátdehydrogenasy (ta je ve vnitřní membráně) a enzymy b-oxidace mastných kyselin, event. další enzymy. V mitochondrii je tok elektronů z NADH nebo FADH2 na O2 spřažen s transportem protonů přes vnitřní membránu do matrix, při čemž se generuje protonmotorická síla. Hlavními složkami řetězce transportujícího elektrony jsou 4 multiproteinové komplexy s definovanou lokalizací na vnitřní membráně: (I) sukcinát-CoQ-reduktasa, (II) NADH-CoQH2-reduktasa, (III) CoQH2¾cytochrom-c-reduktasa, (IV) cytochrom-c-oxidasa. Poslední komplex přenáší elektrony na O2 za vzniku H2O. V matrix jsou také umístěny mitochondriální ribosomy a mitochodriální DNA (=mtDNA), která se liší od chromosomální DNA. Lidský mitochondriální genom je zcela oddělen a obsahuje 16 568 párů bazí (bp), což je 10 000krát méně, než je v nukleárním genomu. Kóduje 13 pouze podjednotek mitochondriálních proteinů, ostatní jsou kódovány jadernou (n) DNA. Většina mitochondriální RNA se odvozuje od mtDNA, ale většina mitochondriálních proteinů je kódována nDNA a tvoří se na ribosomech v cytoplasmě; odkud jsou tyto proteiny přeneseny do mitochondrií. Genetický materiál mitochondrií pochází z mateřského vajíčka(!). Mitochondrie se zmnožují naprosto nezávisle na replikaci jádra a buněčném dělení. Na rozdíl od nDNA není počet molekul mtDNA v jedotlivých buňkách i tkáních konstatní, ale během vývoje se mění. Ve většině buněk je přítomno 103-104 kopií mtDNA; nejvíce se nachází ve zralém oocytu, kde tvoří až třetinu celkového genetického materiálu zárodečné buňky. MtDNA je složena ze dvou řetězců (H a L), nebsahuje introny a má kromě regulačních míst pouze 37 genů. V respiračním řetězci kóduje 7 podjednotek komplexu I (MTND1, MTND2, MTND3, MTND4, MTND4L, MTND5, MTND6), 1 podjednotku komplexu III (MTCYTb), 3 podjednotky komplexu IV (MTCOI, MICOII, MTCOIII), 2 podjednotky komplexu V (MTATP6, MTATP8); dále obsahuje 2 geny pro rRNA a 22 genů pro tRNA. MtDNA nekóduje žádnou podjednotku komplexu II.
Hlavní funkcí mitochondrií je produkce chemické energie ve formě ATP (z ADP a Pi) oxidací substrátů v citrátovém cyklu a b-oxidací mastných kyselin. Zdrojem elektronů je redukovaný nikotinamidadenindinukleotid (NADH), který vzniká při oxido-redukčních reakcích katalyzovaných NAD+-dehydrogenasami isocitrátu, 2-oxoglutarátu, malátu, pyruvátdehydrogenasového komplexu, L-3-hydroxyl-acyl-CoA; dále z redukovaného flavinadenindinukleotidu vzniklého při oxido-redukčních reakcích FAD-dehydrogenas jako je sukcinátdehydrogenasa, dehydrogenasy a-glycerofosfátového kyvadla, dehydrogenasy acyl-CoA při b-oxidaci mastných kyselin.
Poznámka: ATP je univerzálním přenašečem chemické energie v buňce. Zachycuje chemickou energii uvolňovanou při oxidaci živin a přenáší ji do reakcí, které energii vyžadují. Dospělý jedinec při bazálním metabolismu za den přetvoří (ATPÛADP) takové množství ATP, které odpovídá polovině jeho hmotnosti; při velmi těžké práci to může být až 1 000 kg . Většina syntézy ATP se realizuje pomocí enzymu ATP-synthasy (ATP-asa). Tento enzym funguje zvláštním způsobem. Krokem vyžadujícím energii není syntéza ATP z ADP
a anorganického fosfátu, ale navázání ADP a fosfátu k enzymu a uvolnění ATP. ATP-synthasa se skládá z části F0 (má 3 typy podjednotek lišících se počtem proteinů: a, b, c, vázané na membránu), která přenáší protony (funguje jako protonový kanál), a z části F1 (má podjednotky a,b,g,d,e vystupující z membrány), která může být uvolněna do vniřní membrány mitochondrií. Celý komplex připomíná razítko trčící z membrány. Syntéza ATP probíhá na jednotkách b. Jsou-li jednotkou F0 vpuštěny protony po spádu rozdílu jejich elektrochemického potenciálu, lze jejich energii zachytit a využít v komplexu F1 k syntéze ATP. Protony proudí přes membránu prostřednictvím disku c a disk je donucen rotovat; podjednotka g v jedné části F1 se dotýká disku a proto rotuje s ním; podjednotky a a b v druhé části F1 rotovat nemohou, protože jsou zachyceny fixní podjednotkou b, která je ukotvena v membráně. Tedy g-podjednotka rotuje uvnitř cylindru vytvořeného podjednotkami a a b. Jelikož g-podjednotka je asymetrická nutí b-podjednotky podléhat strukturním změnám a vázat ATP a ADP rozdílnou silou. Změna vazebné schopnosti během rotace disku se nazývá Boyerův mechanismus vazebné změny a rotace je řízena tokem vodíkových iontů přes membránu. Je možno ATP-asu označit jako molekulový stroj (Boyer)
a přirovnat ji k razidlu mincí, poháněnému mlýnským (vodním) kolem, kde komponenta F0 představuje kolo, otáčející se tokem protonů. Strukturní změny jsou vlastním razidlem tří mincí v ATP měně, jež jsou vyraženy při každém otočení kola.
Obr. Schématické vyobrazení ATPasy
Mitochondrie jsou jakousi elektrárnou buňky. V aerobních buňkách je glukosa kompletně oxidována na CO2 a H2O (aerobní glykolýza): První fáze (až po pyruvát) nevyžadující O2 probíhá v cytoplasmě s jen malým výtěžkem energie; pak je však pyruvát přenesen do mitochondrií, kde dochází k jeho kompletní oxidaci:
CH3(CO)COOH + 2 1/2 O2 → 3CO2 + 2H2O
Dalším zdrojem energie je b-oxidace mastných kyselin a jiné reakce generující acetyl-CoA, který se dále oxiduje v citrátovém cyklu. Vznikají tak molekuly redukovaného nikotinadenindinukleotidu (NADH) a flavinadenindinukleotidu (FADH2). Tyto koenzymy jsou reoxidovány za současného uvolnění energie (DG°=-613 kcal/mol glukosy), která je z největší části využita na fosforylaci ADP za vzniku ATP (DG°=+ 7,3 kcal/mol ATP). Oxidace koenzymů a fosforylace ADP se nemohou realizovat ve stejné reakci, ale tak, že přenos elektronů z NADH a FADH2 na konečný akceptor, kterým je O2, probíhá postupně cestou elektronového transportního řetězce (respirační řetězec), což umožňuje, aby i volná energie byla uvolňována po malých množstvích.
Obr.: Topografie metabolických pochodů v mitochondriích
Na několika místech během transportu elektronů jsou protony přenášeny přes vnitřní mitochondriální membránu (pro jiné ionty jako Na+, K+, Cl- není prostupná), což vede k vytvoření protonového koncentračního gradientu mezi oběma stranami vnitřní membrány. Protože vnější mitochondriální membrána je volně prostupná pro protony, koncentrace H+ je nižší v mitochondriální matrix (pH 8) než v cytosolu a intermembránovém prostoru (pH 7). Elektrický potenciál napříč vnitřní membránou vzniká „pumpováním“ pozitivně nabitých protonů ven z matrix, která se tak stává negativnější vůči mezimembránovému prostoru. Volná energie vzniklá při oxidaci redukovaných koenzymů je uložena jako elektrický potenciál a jako protonový koncentrační gradient, tj. dohromady jako protonmotorická síla. Pohyb protonů zpět přes vnitřní membránu, tlačený touto silou, je spřažen se syntézou ATP z ADP a Pi, katalyzovanou F0F1-ATPasovým komplexem zvaným též ATP-synthetasa. Tyto komplexy vytvářejí jakési knoflíkové výstupky na vnitřní mitochondriální membráně.
ATP-synthetasa obsahuje 2 oligomerní komplexy. Jeden (F0), který je vnořen do dvojvrstvy vnitřní membrány, se skládá z podjednotek a, b c, druhý (F1) – periferní, má podjednotky a, b, d, e. Podjednotka b katalyzuje přeměnu ADP + Pi na ATP za přívodu energie vzniklé přesunem protonů přes vnitřní mitochondriální membránu na základě elektrochemického gradientu. Takto je velmi těsně propojena oxidace s fosforylací. Toto propojení inhibují tzv. rozpojovači oxidační fosforylace jako je 2,4-dinitrofenol, dikumarol, chloralkarbonylkyanid, fenylhydrazon a také bilirubin.
ATP syntáza je zařízení pro zpětné spřažení, které převádí energii gradientu
elektrochemického potenciálu protonů na energii chemické vazby nebo naopak.
Obr.: Schéma chemiosmotického spřažení
Uvolnění terminální fosfoanhydridové vazby ATP hydrolysou vzniká ADP, anorganický fosfát (Pi) a energie, která je využita v řadě spřažených chemických reakcí, využívaných k různým pochodům buňky.
Obr. : Využití energie ATP
Mitochondriální dysfunkce hraje významnou úlohu při těžším poškození buňky. Za některých patologických stavů dochází k výraznému zvětšení objemu mitochondrií i jejich počtu, ale také ke zmenšení i početnímu úbytku (u buněčné hypertrofie nebo naopak atrofie). Tzv. megamitochondrie bývají nalézány u alkoholové choroby jater nebo u některých nutričních deficiencí.
Dědičné defekty mitochondrií (delece nebo bodové mutace mtDNA) se projevují např. mitochondriálními encefalomyopatiemi. Jde o klinicky heterogenní skupinu chorob, které mají společné morfologické abnormity v mitochondriích, zúpůsobujících různé poruchy mitochondriálního metabolismu jako je: (1) transport substrátu z cytosolu do mitochondrií, (2) utilizace substrátu, (3) enzymy citrátového cyklu, (4) spřažení fosforylace s transportem elektronů, (5) enzymy eletronového transportního řetězce. V klinických projevech se objevuje neprospívání, psychomotorická retardace, známky encefalopatie, myopatie, hepatopatie, hypertrofické kardiomyopatie, také atrofie zrakového nervu provázená slepotou a jako častý laboratorní nález laktátová acidóza pro defekty enzymové aktivity komplexu dýchacího řetězce, pyruvátdehydrogenasy a ATP-synthasy. Také některé nádory (slinné žlázy, thyreoidea, parathyreoidea, ledviny, tzv. onkocytomy) mívají enormně hypertrofické mitochondrie, které buňkám dávají eosinofilní vzhled při histologickém barvení.
V mtDNA bylo popsáno více než 200 bodových mutací, delecí a duplikakací, které vedou k poruchám energetického metabolismu. MtDNA je náchylnější ke vzniku mutací než nDNA, protože je lokalizována v blízkosti vnitřní mitochondriální membrány, kde vznikají reaktivní formy kyslíku. Také není chráněna histony a nemá dostatečné funkční mechanismy pro její opravu. Současný výskyt normální a mutované populace mtDNA v organismu se nazývá heteroplasmie, mutace všech molekul mtDNA homoplasmie. Poměr mezi množstvím mutovaných a normálních mtDNA určuje mitochondriální genotyp; pohybuje se v rozmezí 0 – 100%. Biologické chování buňky se změní v situaci, kdy počet mutovaných mtDNA dosáhne prahu; při něm už buňka nemůže vyrábět dostatečné množství ATP; obvykle to je u heteroplasmií převyšující 80%.
Většina proteinů respiračního řetězce a ATP-synthasy je kódovaná nDNA a jejich syntéza probíhá v cytoplasmě, odkud je do mitochondrií transportována; jen část se tvoří přímo v mitochondriích a je kódována mtDNA. Biogeneze mitochondrií, respektive syntéza komplexů respiračního řetězce a ATP-synthasy je tedy řízena funkčním propojením dvou genetických systémů – nDNA a mtDNA.
Mitochondriální poruchy respiračního řetězce (oxidační fosforylace) u člověka mohou být způsobeny (a) generalizovanou nebo tkáňově specifickou poruchou exprese nDNA s autosomálně dominantním nebo autosomálně recesivním typem dědičnosti, (b) bodovými mutacemi nebo mikrodelecemi mtDNA s maternálním typem dědičnosti, rozsáhlými delecemi a duplikacemi mtDNA se sporadickým výskytem.
Klinické syndromy s genetickými poruchami v mitochondriích
V užším slova smyslu jsou mitochondriální onemocnění způsobena poruchami v oblasti respiračního řetězce, ATP-synthasy, komplexu pyruvátdehydrogenasy a Krebsova citrátového cyklu; o mitochondriální encefalomyopatii se hovoří při současném postižení CNS.
* Syndrom Keamsův a Sayreho je multisystémové onemocnění, které je způsobeno heteroplasmickými delecemi a duplikacemi mtDNA o velikosti 2-8 kb nebo jinými změnami v uspořádání mitochondriálního genomu. Mezi příznaky patří progredující svalová slabost, oboustranná ptóza víček (chronická progresivní externí oftalmoplegie – CPEO), kardiomyopatie, převodní porucha srdečního rytmu, retinitis pigmentosa, ataxie, porucha růstu, porucha tubulárních funkcí vedoucí až k renálnímu selhání, diabetes mellitus, hypothyreóza, hypoparathyreóza, hypopituitarismus, hypogonadismus, Addisonova nemoc.
* Leighův syndrom (subakutní nekrotizující encefalomyopatie) projevuje se už v kojeneckém nebo batolecím věku neprospíváním, hypotonií, hypertrichózou, poruchou zraku a sluchu. Zpomaluje se psychomotorický vývoj, pak zastavuje a dokonce regreduje. V krvi se zvyšuje laktát., v bazálních gangliích a v mozkovém kmeni se objevují nekrotická ložiska. Enzymatické vyšetření ukazuje na poruchu komplexu I nebo IV, eventuelně pyruvátdehydrogenasy.
* Syndrom LHON (Leberova hereditární optická neuropatie) je způsoben bodovou mutací mtDNA (nejčastěji G11778A). Vyskytuje se asi u 2-3% jedinců stižených slepotou.
* Syndrom MELAS (Mitochondriální myopatie-encefalopatie-laktátová acidóza-iktu podobné příhody) se nejčastěji vyskytuje u pacientů s heteroplasmickou mutací tRNALeu v poloze A3243G v mtDNA. Mutace vede k substituci adeninu za guanin v dihydrouridinovém raménku tRNA a způsobuje změnu vazebného místa pro transkripční terminační faktor. Důsledkem je postižení inkorporace leucinu do podjednotek enzymů oxidační fosforylace, syntetizovaných na mitochondriálních ribosomech.
* Syndrom MERRF (myoklonická epilepsie a „ragged-red fibers“) je nejčastěji způsobena heteroplasmickou mutací tRNALys v pozici A8344G v mtDNA., která vede k záměně evolučně konzervovaného guaninu za adenin v TYC raménku tRNA, které hraje významnou roli při interakci tRNA s ribosomy. V klinické obraze bývá myoklonická epilepsie a svalová slabost, méně často ataxie, kardiomyopatie, porucha percepce sluchu, externí oftalmoplegie a u dětí psychomotorická retardace. V krvi je zvýšený laktát a alanin. Svalová biopsie ukazuje poruchu aktivity NADH-CoQ-reduktásy a cytochrom c–oxidasy. Mikroskopické vyšetření svalových vláken ukazuje na přítomnost „ragged red fibers“ = rozeklaných červených vláken.
* Syndrom NARP (neurogenní svalová slabost s ataxií a retinitis pigmentosa) je způsoben heteroplasmickými mutacemi v genu pro podjedtku 6 ATP-synthasy. Klinicky se projevuje psychomotorickou retardací, hypotonií (někdy naopak quadruspasticitou), ataxií, retinitis pigmentosa, kardiomyopatií, heptopatií. V likvoru je zvýšená hladina laktátu a alaninu. .
* Syndrom Pearsonův se projevuje už v dětství zpomalením růstu, poruchou zevně sekretorických funkcí pankreatu a těžkou makrocytární sideroblastickou anemií s vakuolizací prekurzorů červených i bílých krvinek.
* Syndrom Alpersův (progresivní infantilní poliodystrofie) je neurodegenerativní onemocnění s postižením jater, křečemi, poruchou zraku a psychomotorickou retardací. Postižené děti často umírají ve status epilepticus.