4.3. Ribosomy
Eukaryontní ribosom je větší než prokaryontní. Tvoří jej podjednotky: velká 60S podjednotka, obsahující tři ribosomální ribonukleové kyseliny 28S, 5,8S a 5S rRNA a dále 45% proteinů; malá podjednotka skládající se z 18S rRNA a 33% proteinů. Mitochondrie a chloroplasty mají své vlastní ribosomy, které jsou podobné ribosomům prokaryot strukturou i citlivostí vůči inhibičnímu účinku antibiotik při translaci. Ribosomy jsou složeny z více než 50 druhů bílkovin – ribosomální proteiny a několika druhů ribosomální RNA. Ta (rRNA) je tvořena transkripcí v jádře, kde je také spojena s ribosomálními proteiny (ty se tvoří v cytoplasmě a do jádra jsou dopraveny); vzniklý komplex ve formě malé a velké podjednotky je transportován zpět do cytoplasmy, kde se účastní proteosyntézy.
Ribosomy jsou tedy místem, kde probíhá syntéza proteinů; ribosomy jsou katalyzátory proteosyntézy. U eukaryot se vyskytují buď jako jednotlivé v cytosolu (monosomy) nebo sdružené a připojené na jednu informační ribonukleovou kyselinu (mRNA) jako tak zvané polysomy. Monosomy bývají také připojeny na endoplasmatické retikulum, kde syntetizují proteiny secernované nebo transportované do jiných organel.
Jak bylo řečeno, ribosomy jsou komplexem složeným z jednotlivých molekul ribosomální RNA (rRNA) z proteinů (více než 50%). Komplex je organizovaný do dvou podjednotek: malé a velké, označených Svedbergovou sedimentační konstantou S.
Obr.: Schéma složení eukaryontního ribosomu
Ribosomy, které nejsou navázány na endoplasmatické retikulum se nazývají volné, ačkoliv i ty jsou někdy připojeny k cytoskeletu. Není však strukturální rozdíl mezi ribosomem volným a vázaným; oba typy pocházejí ze stejného poolu a vrací se do něho po ukončení translačního procesu. Proteiny syntetizované na vázaných ribosomech zahrnují proteiny transmembránové, endoplasmatického retikula, Golgiho aparátu, lyzosomů, endosomů a proteiny z buňky secernované. Naproti tomu volné ribosomy se podílí na syntéze cytosolových proteinů a na proteinech periferní membrány a dále na proteinech určených pro jádro, mitochondrie a peroxisomy. Úkolem ribosomového komplexu, na kterém se děje syntéza polypeptidového řetězce je rychlý a přesný přenos genetické informace (translace) z informační RNA (mRNA) do tvořícího se proteinu tak, že ribosom se pohybuje podél mRNA, zachytává komplementární molekuly transferové RNA (tRNA), přinášející vhodné aminokyseliny, drží je ve správné pozici a spojuje na nich navázané aminokyseliny do postupně narůstajícího polypeptidového řetězce.
Nasměrování proteinů syntetizovaných na ribosomech do míst určení se děje mechanismem inserce specifické signální sekvence tj. signálních peptidů nebo signálních rozpoznávacích částic a za účasti receptorů pro signální rozpoznávací částice.
Mechanismus syntézy proteinů
Syntézu proteinové molekuly možno rozdělit do 3 stádií: (1) iniciace, (2) elongace, (3) terminace.
(a) Iniciace translace (přenosu genetické informace) začíná tvorbou iniciačního komplexu 40S, který tvoří pás monocistronové mRNA, s iniciačním kodonem – AUG a s čepičkou 7-methylguanylátu na svém 5-konci, která je potřebná pro iniciaci translace. Dále to jsou iniciační faktory (elF-1 až elF-10), ribosomální podjednotka 40S, která umožňuje (ve vazbě s elF-4) asociaci dvou ribosomálních podjednotek, met-tRNAi tj. tRNA přinášející nemodifikovaný methionin k iniciačnímu komplexu 40S (rozdíl od methionyl-tRNAm přinášející Met do rostoucího peptidového řetězce). Iniciace potřebuje energii, která se bere hydrolýzou GTP a ATP.
Mechanismus tvorby iniciačního komplexu
Začíná tvorbou preiniciačního komplexu vzniklého z ternárního komplexu (elf-2, GTP a met-tRNAi) vazbou na podjednotku 40S RNA. Vazba mRNA na iniciační komplex je komplikovanější a přesné kroky nejsou ještě známy. Podílí se na ní další iniciační faktory (elF-3, elF-4A, elf-4B, elf-4C, elf-4F). Faktor elF-4A ještě obsahuje podjednotku, která má funkci proteinu vázajícího cap (CBP), která je tou komponentou, s kterou se spojuje mRNA; toto napojení podporují faktory elF-4A a elf-4-B. Hydrolýzou ATP (uvolnění energie) a vazbou elF-4A dochází ke rozvinutí sekundární struktury v 5-nepřenesené oblasti mRNA. Tak je dokončen vznik iniciačního komplexu 40S.
5´-konec nepřenesené oblasti mRNA, různé délky (obvykle 40 – 80 nukleotidů) se podílí na rozpoznání iniciačního kodonu. V 90% je to oblast AUG (první od 5´-konce). Nejobvyklejší sekvence kolem iniciačního kodonu bývá AXXAUGGG, kde je jakákoli baze. Není-li použito této první AUG sekvence, pak to bývá sekvence YXXAUGY, kde Y je pyrimidinová baze (uracil nebo thymin). Předpokládá se, že 40S ribosomální podjednotka se váže v blízkosti
5´-konce mRNA a že odtud dochází ke „skenování“ směrem k 3´-konci až se objeví první AUG v požadovaném uspořádání. Pro tento „skenovací“ proces je zapotřebí energie z ATP.
Po té následuje tvorba 80S iniciačního komplexu, tímže se napojí 60S podjednotka na 40S iniciační komplex. Před tím je odstraněn elF-2-GDP a elf-3, a to za účasti elf-5 a elf-4. Komplex elf-2-GDP se přitom mění na elf-2-GTP, účinkem faktoru elf-2B. Při úplné kompletaci iniciačního komplexu 80S dochází k uvolnění všech zbývajících iniciačních faktorů.
Poznámka:
Každá tRNA, specifická pro určitý druh aminokyseliny, obsahuje sekvenci tří nukleotidů - antikodon -, který je komplementární ke kodonu mRNA. Aminokyselina je kovalentně vázána k odpovídající tRNA díky činnosti specifických enzymů (aminoacyl-tRNA-syntetasy), které rozpoznávají obě molekuly.
V průběhu translace pak mRNA prochází ribosomem (Obr.) tak, že každý kodon postupně váže odpovídající tRNA, která přináší kodovanou aminokyselinu. Antikodon je umístěn ve smyčce struktury jetelového listu naproti stonku obsahujícím koncové nukleotidy. Během proteosyntézy je požadovaná tRNA vybrána pouze na základě interakce kodon-antikodon. Aminokyseliny se na tomto procesu nepodílejí. Syntéza peptidů probíhá od jejich N-konce k C-konci; ribosomy pak čtou mRNA ve směru 5´→ 3´. K růstu řetězce dochází jeho připojováním na aminokyselinový zbytek aminoacyl-tRNA , která vstupuje do ribosomu. Na ribosomu jsou dvě hlavní vazebná místa pro t-RNA: A-místo pro aminoacyl-tRNA a P-místo pro peptidyl-tRNA, kde dochází k vytvoření peptidové vazby. Existuje ještě třetí místo označované písmenem E, které je přechodně obsazeno deacylovaným koncem tRNA, po té když je přenos aminokyseliny ukončen a tRNA má být z ribosomu vyloučena.
Obr.: Ribosomální syntéza polypeptidu na matrici mRNA
(b) Elongace
K tomuto procesu je zapotřebí existence 80S iniciačního komplexu, aminoacyl-tRNA, GTP
a elongační faktory eEF-1 , eEF-1 a eEF-2. Pohyb ribosomu po mRNA je velmi pečlivě řízen: Ribosom obsahuje 4 vazebná místa – jedno pro mRNA a 3 různá pro tRNA (A, P, E).Vlastní elongace se pak děje vznikem peptidové vazby mezi aktivovanou aminokyselinou napojenou k tRNA na P místě (nejprve je to met-RNA) a amino-skupinou aminoacyl-tRNA v místě A. Reakce ja katalyzována peptidyltransferasou, která je integrální součástí 60S podjednotky. Peptidová vazba vzniká v druhém kroku elongačního cyklu nukleofilním posunem P-vazebného místa tRNA NH2-skupinou připojenou k 3-aminoacyl-tRNA navázanou v A-místě. Narůstající polypeptidový řetězec je tak prodloužen na svém C-konci o jeden zbytek a přenesen na tRNA v A-místě procesem, který se nazývá transpeptidace.
V posledním kroku je tRNA v P-místě přesunuta do E-místa, čemuž se říká translokace.
(c) Terminace
Ukončení syntézy polypeptidového řetězce nastane je signalizován přítomností jednoho ze 3 terminačních neboli stop-kodonů UAA, UAG nebo UGA. Tyto kodony nejsou rozpoznány žádnou tRNA a není jím přisouzena žádná aminokyselina; tím signalizují konec translace. Místo tRNA se na terminační kodon v A-místě naváže terminační (uvolňovací) faktor sdružený s GTP, které mění aktivitu peptidyltransferasové aktivity ribosomu tak, že místo aminokyseliny použije H2O a vytvoří tak namísto peptidové vazby koncovou (terminální) karboxylovou (-COOH) skupinu hotového polypeptidového řetězce. Energie potřebná k disociaci ribosomální podjednotky se získává hydrolýzou GTP.
Syntéza většiny proteinů trvá 20 sekund až několik minut. Tato se ještě zkracuje tím, že na jedné mRNA pracuje několik ribosomů; k tomu přispívá systém polyribosomů.
Poznámka:
Léky a inhibitory proteosyntézy
Streptomycin je aminoglykosid, který se váže na fmet-tRNAf (u bakterií), čímž brání jejímu napojení na P-místo v iniciálním komplexu. Účinek je lokalizován na S12-proteinu 50S-ribosomální podjednotky. Streptomycin může také způsobit nesprávné čtení sekvence mRNA.
Tetracyklin jako širokospektré antibiotikum se váže na 30S ribosomální podjednotku a inhibuje vazbu s aminoacyl-tRNA.
Erythromycin jako antibakteriální chemoterapeutikum inhibuje translokační reakci vazbou na 50S podjednotku.
Chloramfenikol inhibuje peptidyltransferasu velké podjednotky ribosomu u prokaryot.
Cyklohexemid inhibuje proteosyntézu u eukaryot vazbou na 60S podjednotku a inhibicí peptidyl-transferasové reakce.
Puromycin je analog aminoacyl-adenosinové skupiny v aminoacyl-tRNA a způsobuje předčasné ukončení translace jak u prokaryot tak u eukaryot. Soutěží o vazbu na A-místu s aminoacyl-tRNA. To vede k předčasnému ukončení translace.
Difterotoxin je toxin produkovaný lyzogenním bakteriofágem, který infikuje Corynebacterium diphteriae. Tento mikrob u člověka způsobuje infekci nosohltanu (záškrt). Toxin katalyzuje přenos ADP-ribosy z NAD+ na posttranslačně modifikovaný histidin v eEF-2 a inhibuje tak translokační krok elongace. Účinek toxinu je katalytický, takže i malé množství může způsobit zánik buňky; proto může být průběh onemocnění letální.
Ricin je protein produkovaný fazolemi. Jde o A-glykosidasu, která uvolňuje jeden adenosin z 28S rRNA, což inhibuje syntézu proteinů u eukaryot. Podává se jako laxativum. Delší užívání může způsobit trvalý průjem s těžkými následky.
α-Sarcin je fungální toxin, který štěpí (jako ribosomální RNAasa) 28 rRNA, což vede k inhibici vazby aminoacyl-tRNA.
Kolicin E3 je vylučován některými kmeny E. coli. Toxin inhibuje proteosyntézu u jiných bakterií. Štěpí totiž specificky 16S tRNA, což způsobuje inhibici iniciace.
Regulace translace
Na rozdíl od prokaryot, jejichž mRNA má životnost několik minut, eukaryontní organismy potřebují translační kontrolu. Doba života eukaryontní mRNA jsou řádově hodiny až dny. Příkladem mohou být interferony. Jde o glykoproteiny vylučované buňkami obratlovců, infikovaných virem Vazbou na specifické povrchové receptory ostatních buněk indukují interferony rezistenci k replikaci širokého spektra RNA- i DNA-virů. Zabraňují proliferaci virů především blokováním proteosyntézy v infikovaných buňkách.
Mechanismus účinku je dvojí:
(1) Indukce tvorby proteinkinasy, která v přítomnosti dsRNA fosforyluje α-podjednotku iniciačního faktoru eIF-2 a tím dochází k inhibici iniciace proteosyntézy
v ribosomech..
(2) Indukce tvorby (2´,5´)-oligoadenylátsynthetasy, která katalyzuje v přítomnosti dsRNA syntézu neobvyklého oligonukleotidu - pppA(2´p5´A)n - který aktivuje už existující RNasu L , která degraduje mRNA; toto pochopitelně zarazí proteosyntézu.
Fosforylace a defosforylace různých proteinů hraje dominantní úlohu při regulaci proteosyntézy v savčích buňkách. Stupeň fosforylace eIF-2B, eIF-3, eIF-4B a eIF-4F a ribosomálních proteinů S6 koreluje s rychlostí translace. Faktor eIF-4E je aktivován fosforylací proteinkinasou C (skupina enzymů tvořící důležitý člen signální transdukce), regulovanou hormony a která se uplatňuje v řadě metabolických funkcí buňky, mezi jinými v proliferaci a růstu buněk. To naznačuje jakým způsobem je rychlost proteosyntézy koordinována s rychlostí růstu buněk a proliferací. Zvýšená exprese eIF-4F v některých typech buněk má za následek jejich maligní transformaci a nekontrolovanou proliferaci.
Mechanismus interakce některých antibiotik a baktérií
Ribosomy, které jsou místem proteosyntézy obecně, tedy i u bakterií, jsou hlavním cílovým místem účinku přirozených i syntetických antibiotik. Primárním místem účinku (i když též ribosomální proteiny mohou ovlivnit vazbu a aktivitu antibiotik) je rRNA.
Terapeutický účinek antibiotik však může být znehodnocen vznikem rezistence patogenních bakterií vůči některým antibiotikům. Tato rezistence má řadu mechanismů jako je vypuzení léku z bakterie, jeho inaktivace nebo alterace cílového místa účinku. Řada bakteriálních kmenů se stává rezistentním změnou specifických nukleotidů v 23S rRNA v aktivním centru peptidyltransferasy. Tak chloramfenikol, který blokuje aktivitu peptidyltransferasy znesnadněním vazby transferové RNA na A-místo enzymu (brání tak vytvoření peptidové vazby v tvořícím se polypetodovém řetězci), má několik reaktivních skupin, které mohou vytvářet vodíkové můstky s různými nukleotidy v prohlubni peptidyltransferasy. Mutace nukleotidu v blízkosti této potenciální vazby navodí bakteriální rezistenci. Clindamycin (patří mezi linkosamidy) neblokuje A-místo ale P-místo, avšak v mechanismu účinku se od chloramfenikolu neliší. Naproti tomu makrolidy jako erythromyciny (clarithromycin a roxithrocin) neblokují aktivitu peptidyltransferasy (i když se váží na kruh peptidyltransferasy), ale blokují „tunel“, kterým je transportován nově vytvářený peptid ven z centra peptidyltransferasy. „Zastínění“ možné vazby na základě vodíkového můstku mezi makrolidovým antibiotikem a příslušným specifickým nukleotidem napojením CH3-skupiny, vzniklé katalytickým účinkem bakteriální methylasy rezistentního kmene, se stane antibiotikum neúčinné.